Topoisomerase I 助力5min完成克隆

拓扑异构酶(Topoisomerase) 是存在于细胞核内的一类酶，它们能够切断单链或双链DNA的磷酸二酯键，然后重新缠绕和封口来更正DNA连环数，从而控制DNA的拓扑状态。DNA拓扑异构酶分为两类，I型DNA拓扑异构酶（DNA Topoisomerase I）和II型DNA拓扑异构酶(DNA Topoisomerase II）。   Topoisomerase I是由美国科学家Stewart Shuman在1990年从牛痘病毒中发现的，同时具有限制性内切酶活性和连接酶活性，能够在DNA复制过程中切断并重新连接DNA。Topoisomerase I可以在无需ATP供能的情况下切断DNA链，在切割单链DNA后，会与末端DNA片段形成暂时性中间体，并在释放压力后重新连接切口。由于Topoisomerase I具有切断、连接DNA的这种特性，常被用于克隆载体的构建（如TOPO克隆）以及NGS 建库中的接头连接等。

 

图1. Topoisomerase I原理图^[1]

 

  TOPO克隆   TOPO克隆是一种基于Topoisomerase I的PCR产物快速克隆系统，利用Topoisomerase I的连接原理，无需DNA连接酶，可在5 min内高效连接DNA片段。Topoisomerase I识别并切割TOPO载体上的结合位点，切割完成后，与TOPO载体结合形成复合物。目的DNA片段可在Topoisomerase I的作用下与TOPO载体连接，形成克隆。  

技术路线

 

识别切割：Topoisomerase I识别DNA序列5’-(C/T)CCTT-3’，并且能够在该位点对DNA进行切割；

 

固定：Topoisomerase I借助DNA断裂的能量将酪氨酸残基与载体DNA 3’末端形成共价键，从而固定在DNA载体上；

 

连接：在加入目的DNA片段（PCR Product）后，目的DNA片段的5'端羟基攻击载体片段的磷酸键，释放能量，使得目的DNA片段的 5'端羟基与载体片段的3'端磷酸基团连接在一起；

 

脱落：Topoisomerase I从载体分子上脱落。

 

图2. TOPO原理图

 

  翌圣Topoisomerase I   翌圣Topoisomerase I (Cat#14971ES)由翌圣镁孚泰生物ZymeEditor酶进化平台经过重组表达获得，无外切酶残留、低宿主残留，可应用于NGS 建库中的接头连接、TOPO克隆等！

 

  部分数据展示   01 应用到TOPO克隆，克隆效果优于A品牌     使用不同批次的Topoisomerase I进行TOPO克隆，分别连接2 kb的粘性末端、4 kb的平末端，实验结果表明，翌圣Topoisomerase I运用到TOPO克隆中，克隆效果优于A品牌，阳性克隆率达100%（8/8）。

 

图3. Topoisomerase I运用到TOPO克隆效果图

 

02 外切酶残留     将50 U不同批次的Topoisomerase I分别与相应的底物DNA在37℃孵育4 h，琼脂糖凝胶电泳检测结果表明，翌圣Topoisomerase I无外切酶残留。

图4. 外切酶残留检测

 

03 E. coli基因组DNA残留< 1 copy/5U     对不同批次的Topoisomerase I (Cat#14971ES)进行E. coli基因组DNA残留检测，结果显示翌圣Topoisomerase I宿主基因组DNA残留远低于1 copy/5U。

图5. E. coli基因组DNA残留检测

 

 

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产品名称	产品货号	产品规格
Topoisomerase I	14971ES	100 / 500 U