上新 | 热稳定、低宿主残留的RNase HII来咯！

RNase HII是一种核糖核酸内切酶，识别DNA-rN-DNA/DNA双链，在DNA掺入核糖核苷酸的位点进行切割，但对单链RNA切割活性极低，对dsDNA、ssDNA无切割活性。RNase HII在50°C~75°C间具有活性，在70~75°C具有最佳活性。RNase HII作用时，在单核糖核苷酸残基处从 5’端进行切割，切割后产生一个 5′ 端磷酸基团和一个 3′ 端羟基（图1）。由于RNase HII具有在DNA掺入核糖核苷酸位点进行单点切割且对dsDNA、ssDNA无切割活性的特性，RNase HII常用于启动反应（引物激活并延伸）的“开关”，从而实现特异性扩增，在RNase HII依赖性PCR(rhPCR)、环介导等温扩增技术(LAMP)等应用广泛。

 

图1. RNase HII反应原理示意图

 

 

 

RNase HII应用

  01 依赖于Rnase HII的PCR (rhPCR)     rhPCR是在常规聚合酶链反应（PCR）的基础上增加了Rnase HII和封闭式可切割rhPCR引物，消除了反应过程中引物二聚体的形成，极大减少了错误扩增的出现，显著提升了反应的特异性、灵敏度和重复性，在单核苷酸多态性（SNP）、基因分型、多靶标同时检测、环境核酸检测等方面具有一定的优势。
rhPCR引物是在高度保守的目标寡核苷酸序列区域内插入1段RNA碱基序列，形成DNA-RNA-DNA的碱基序列，并且该引物的3'-末端被化学基团封阻，该引物未切割时无法正常延伸。Rnase HII可以特异性地水解DNA-rN-DNA/DNA杂合链中的RNA，但不能水解单链或双链DNA或RNA中的磷酸二酯键。因此只有当封闭引物与靶DNA互补时，Rnase HII才能使DNA-rN-DNA/DNA杂合链在RNA碱基的5'-侧发生裂解，留下具有3'-羟基的DNA寡核苷酸，该3'-羟基DNA寡核苷酸能够起到引物的作用，从而允许引物延伸。rhPCR利用Rnase HII的特异性作用，实现了对DNA-rN-DNA/DNA杂合链的特异水解，从而实现引物的准确延伸，提升了反应的特异性。

 

图2. rhPCR原理图^[1]

 

02 环介导等温扩增技术(LAMP)     环介导等温扩增技术(LAMP)是一种简便、快速的基因扩增方法，能在等温条件下，短时间内进行核酸扩增。但由于在常温配制过程中，DNA聚合酶已经开始工作，形成非特异性的错配，容易产生少量错配和引物二聚体，这些轻微的污染都会造成假阳性。
将RNase HII应用于LAMP扩增体系后，能有效解决LAMP技术的假阳性问题，为LAMP技术更加广泛的应用于临床诊断。如图3所示，利用Rnase HII引物激活的LAMP方法(PA-LAMP)，当引物与靶ssDNA配对时，Rnase HII酶特异性切割引物上的RNA，激活引物，从而允许引物延伸，实现特异性扩增，有效减少体系中的假阳性。

 

图3. PA-LAMP原理示意图^[2]

 

 

翌圣RNase HⅡ

  翌圣的RNase HII（Cat#14539）来源于深渊热球菌 (Pyrococcus abyssi, P.a.)，由翌圣镁孚泰生物ZymeEditor™重组表达而来，无核酸外切酶、切口酶、RNase残留，低宿主残留，有效减少体系假阳性。翌圣RNase HII极度耐热，95°C孵化45 min后，活性几乎不损失，可与rhPCR各反应体系兼容，也适用于LAMP等。

 

 

部分数据展示

  01 E. coli基因组DNA残留< 0.01copies/1 U     对不同批次的RNase H II (Cat#14539ES)进行E. coli基因组DNA残留检测，结果显示翌圣RNase H II宿主基因组DNA残留远低于0.01 copies/1 U。

 

图4. E. coli基因组DNA残留检测

 

02 95℃耐热性测试    

对RNase H II (Cat#14539ES)进行95℃加热0~45 min后，测试RNase HII的酶活结果，结果表明翌圣RNase HII加热45 min后，酶活几乎没有损失。

 

图5. 95℃耐热测试

 

03 无核酸外切酶、切口酶、RNase残留     将1 U不同批次的RNase HII分别与相应的底物DNA/RNA在37℃孵育4 h，琼脂糖凝胶电泳检测结果表明，RNase HII无核酸外切酶、切口酶、RNase残留。

 

图6. 核酸外切酶、切口酶、RNase残留检测结果

 

 

 

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产品应用	产品名称	产品货号
rhPCR、LAMP	RNase HII(2 U/μL)	14539ES
rhPCR	Hieff UNICON® Hotstart E-Taq DNA Polymerase, 5 U/μL	10726ES
RT-LAMP	Hieff® Bst Plus DNA Polymerase (40 U/μL)	14402ES
	Hifair® Ⅲ Reverse Transcriptase 第三代耐热逆转录酶	11111ES