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翌圣生物（Yeasen）
试剂/耗材
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Sino Biological
抗体/蛋白质/抗原/多肽
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翌圣生物科技（上海）股份有限公司
入驻年限：19 年
- 联系人：
翌圣生物
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上海
- 业务范围：
体外诊断、耗材、技术服务、抗体、ELISA 试剂盒、细胞库 / 细胞培养、试剂
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生产厂商
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公司新闻/正文
CIK细胞制备方法及细胞因子的作用
892 人阅读发布时间：2024-07-19 11:00
背 景
CIK是“Cytokine-Induced Killer Cells”的缩写，中文全称为“细胞因子诱导的杀伤细胞”。CIK细胞来源于CD3+CD56-T细胞, 是激活的Ⅱ型T淋巴细胞且同时兼具NK细胞的杀伤特性。但CIK细胞在外周血中含量甚微(约1%-5%)。因此要将CIK细胞用于临床治疗, 首先必须进行大量扩增。CIK细胞的产生过程大致如下：利用密度梯度离心法将患者或健康人外周血中单核细胞分离出来后, 通过添加外源性细胞因子如IFN-γ、IL-2、IL-1、CD3单抗进行体外诱导扩增。体外扩增2周-4周后, 培养基中出现大量具有强抗癌活性的异质细胞群, 即为CIK细胞。CIK细胞具有杀瘤活性高、杀瘤谱广，对正常组织毒性低，体外可高度扩增等特点。该细胞对肿瘤细胞的辨认能力非常强，好像 “ 细胞导弹 ” ，能 “ 点射 ” 肿瘤细胞，但不会伤及 “ 无辜 ” 的正常细胞。因而，CIK 细胞治疗是目前临床上广泛使用的过继性免疫治疗细胞。
图1.CIK细胞制备流程[1]
CIK培养用细胞因子和抗体
白细胞介素-2 (IL-2 )
IL-2是引起T细胞增殖最重要的细胞因子。IL-2通过其受体共用链IL-2Rβ链和γ链, 经Jak/Stat信号转导通路参与细胞增殖, 同时促进NK细胞和T细胞定向分化为效应细胞发挥杀伤作用。
干扰素-gama (IFN-γ )
FN-γ对提高细胞毒活性非常重要, 不同的添加顺序与细胞毒活性密切相关。将IFN-γ添加在IL-2之前可以明显提高细胞毒活性, 其机制在于IFN-γ可以诱导外周血淋巴细胞表面IL-2受体(IL-2R)的高表，从而会增强T细胞对IL-2促增殖反应的敏感度和强度。
白细胞介素-1a（IL-1a）
IL-1a也可以提高外周血淋巴细胞表面IL-2R的表达。当IL-1a与IFN-g和激发型CD3单抗合用时，可以明显提高CIK 的细胞毒作用。
CD3激发型单抗
T细胞活化的第一信号来自于T细胞表面的受体，即T细胞抗原受体(T cell antigen receptor, TCR)与APC提呈的抗原的特异性结合，也就是T细胞对抗原的特异性识别。CD3分子在T细胞活化信号的转导中起着极其关键的作用。CD3激发型单抗与T细胞表面CD3分子特异性结合后，可引起CD3分子胞浆区ITAM基序中酪氨酸的磷酸化，进而导致T细胞增殖和活化的下游信号的激活，从而使T细胞增殖和活化。也就是说，CD3激发型单抗能够模拟抗原与TCR/CD3复合物的识别和激活过程，从而引起T细胞的增殖与活化，因此是CIK细胞培养中不可或缺的刺激因素。
此外，CD3激发型单抗需要注意克隆号。克隆号为OKT3的CD3激发型单抗可以刺激所有人的T细胞的增殖，而其它克隆号的CD3激发型单抗仅能刺激一部分人的T细胞。因此，在进行CIK培养时，最好选用OKT3克隆。
细胞制备
用血细胞分离机采集患者自身的外周血单个核细胞50-100mL；
淋巴细胞分离液密度梯度离心法进一步纯化单个核细胞(PBMC)；
无血清培养液洗涤2次，获得纯度在90%以上的PBMC。
将PBMC按1-2 x 106/ml的浓度悬浮于无血清培养液中，加入1,000 U/ml 的重组人IFN-g，37℃，5%CO2培养箱中培养；
24h后加入50ng/ml的CD3 单克隆抗体和300 U/ml 的重组人IL-2，刺激CIK 细胞的生长和增殖；此时也可同时加入100 U/ml的重组人IL-1a；
每3天半量换液或扩瓶一次，并补加重组人IL-2 300 U/ml；
在培养的第14d，收获CIK细胞。
台盼蓝染色检测：活细胞应在80%以上；
流式细胞仪检测细胞表面CD3、CD8、CD56等分子的表达：CD3+CD56+细胞的比例应在20%以上；
细胞杀伤实验：以CIK细胞为效应细胞，以肿瘤细胞(可为原代肿瘤细胞或肿瘤细胞株)为靶细胞，将效应细胞与靶细胞按10 : 1(数目比) 的比例加入96 孔U 型板中，每孔含靶细胞1 x 104个，终体积为200 ml，设3个复孔。培养4h，然后取培养上清，用乳酸脱氢酶(LDH) 试剂盒检测效应细胞对靶细胞的杀伤率。
收获细胞前，取少量培养物进行细菌、真菌培养，并检测支原体、衣原体，及内毒素。
推荐试剂
|
应用 |
产品名称 |
货号 |
规格 |
|
CIK细胞培养 |
Human IL-2 |
90103ES |
10μg/100μg |
|
Human IFN-gama |
91207ES |
20μg/50μg/100μg |
|
|
Human IL-1α |
90100ES |
2μg/10μg/50μg |
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|
CIK细胞质控 |
台盼蓝染色法细胞活力检测试剂盒 |
40208ES |
100T/500T |
|
内毒素检测试剂盒 |
60401ES06 |
17T |
|
|
一步法快速支原体检测试剂盒 |
40612ES |
25T/100T |
|
|
乳酸脱氢酶(LDH)细胞毒性检测试剂盒 |
40209ES76 |
500 T |
参考文献
[1] Jingting Jiang, Changping Wu &Binfeng Lu .Cytokine-induced killer cells promote antitumor immunity[J]. Journal of Translational Medicine volume 11, Article number: 83 (2013) .