【Chemical Science】双功能荧光分子检测富集5醛基尿嘧啶

    众所周知，一卵双生的双胞胎也不可能长得一模一样，那么为什么具有相同的遗传物质的双胞胎（DNA序列）却在实际的生长过程中并非长得全部一样呢（基因的表达）？表观遗传学领域在这个方面有深入的探讨。

    DNA作为遗传物质在自然界的影响下会发生碱基修饰、突变甚至是缺失。DNA的甲基化和去甲基化就是生命过程中非常重要的一个环节。在去甲基化的过程中胞嘧啶的修饰物会经历从正常胞嘧啶（C）到5hmC（5-羟甲基胞嘧）再到5fC（5-甲酰基胞嘧啶），进一步再氧化为5caC（5-羧基胞嘧啶）的过程，而胸腺嘧啶也可以被TET酶氧化成5hmU。最-新研究发现醛基修饰的尿嘧啶（5fU）可能在表观遗传学中也会起到一定的作用，例如在引入碱基错配，改变DNA的结构等。通过化学手段，对生命体稀少的有着特殊修饰的碱基的选择性识别和富集是极其有必要的。
 
研究背景
     2014年德国慕尼黑大学Thomas Carell教授首次报道了TET酶可以氧化胸腺嘧啶变成5羟甲基尿嘧啶（Nat. Chem. Biol. 2014, 10, 574），这一结果揭示了胸腺嘧啶（T）的氧化产物（5hmU、5fU、5caU）可能存在着一定的表观学意义（T的氧化关系见图1）。2015年剑桥大学Balasubramanian shanker筛选了一系列的生物素化的有机小分子用于5醛基尿嘧啶的富集（J.Am. Chem. Soc., 2015, 137, 9270），并于今年，将其用在针对真核生物的寄生虫利什曼原虫（eukaryote parasite Leishmania）的5羟甲基尿嘧啶的全基因组测序（Genome Biol，2017,18，23)）。
 
 
图1 胸腺嘧啶（T）的氧化关系图
 
传统的5fU-DNA链的合成主要通过Pt催化-氧化锇氧化-高-碘-酸钠氧化，由于其使用的催化剂剧毒限购，对设备要求高，使得很长时间5fU-DNA合成没有显著的突破。2017年武汉大学首次报道了一个丙二醇保护的5fU固相合成DNA单体，并将其结合到了传统的DNA固相合成中，实现了对这一技术的突破（Nano Res., 2017, DOI:10.1007/s12274-017-1445-2.）。（图2）
研究思路
近日，国际著名学术期刊《Chemical Science》（IF=9.144）发表了武汉大学在这个领域内的最-新成果。该研究团队设计合成一个生物素化的含有邻苯-二胺结构的萘酰亚胺探针，并将其用于荧光检测在Hela细胞中经过伽马射线诱发产生的5fU，以及实现对5fU的选择性富集。其中小分子的作用机理是通过邻苯-二胺中的氨基富裕的电子发生PET效应，猝灭了萘酰亚胺的荧光。当探针分子高选择性的与5fU发生共价作用以后，PET效应消失，荧光重新恢复，并且这个探针偶联有生物素，可以在后期应用于生物素-亲合素系统(Biotin-Avidin—System,BAS)，实现对5fU的选择性富集。（图3）

图3 基于PET荧光淬灭效应选择性富集荧光检测的生物素化的邻苯-二胺-萘酰亚胺探针分子

部分简写词语的含义
5fU：5醛基尿嘧啶
5hmU：5羟甲基尿嘧啶
5caU：5羧基尿嘧啶
 
TET：Ten-eleven translocation，是生物体内存在的一种α-酮戊二酸（α-KG）和2价Fe离子依赖的双加氧酶。
 
    光致电子转移(PET)：光致电子转移是指电子给体或电子受体受光激发后，激发态的电子给体与电子受体之间发生电子转移从而导致荧光的淬灭过程。具体PET过程如下：在光激发下，具有电子给予能力的键合基团能够将其处于最高能级的电子转入激发态下荧光基团空出的电子轨道，使被光激发的电子无法直接跃迁到原基态轨道发射荧光，从而导致荧光的淬灭;当键合基团与底物结合后，降低了键合基团的给电子能力，抑制了PET过程，荧光基团中被光激发的电子可以直接跃迁回到原基态轨道，从而增强了的荧光基团的荧光发射。因此在未结合底物前，传感器分子表现为荧光淬灭，一旦键合基团与底物相结合，荧光基团就会发射荧光。
 
    生物素-亲合素系统(Biotin-Avidin—System,BAS)：生物素－亲合素系统（Biotin-Avidin—System,BAS）是70年代末发展起来的一种新型生物反应放大系统。随着各种生物素衍生物的问世，BAS很快被广泛应用于医学各领域。近年大量研究证实：生物素—亲合素系统几乎可与目前研究成功的各种标记物结合。生物素与亲和素之间高亲合力的牢固结合以及多级放大效应，使BAS免疫标记和有关示踪分析更加灵敏。它已成为目前广泛用于微量抗原、抗体定性、定量检测及定位观察研究的新技术。

研究结果
1、生物素化的邻苯-二胺-萘酰亚胺探针分子对含有5fU-DNA链的选择性反应
研究人员首先尝试了含有5fU的人工合成的DNA链，通过高效液相色谱，DNA凝胶电泳，荧光仪器以及聚合酶中止反应证明了探针分子对5醛基尿嘧啶反应的高选择性（见图4）。

图4 生物素化的邻苯-二胺-萘酰亚胺探针分子选择性与5fU反应

2、对伽马射线处理Hela细胞的成像
作者将Hela细胞分成了三组，分别是进行伽马射线照射，不加化合物；不进行伽马射线照射，加化合物；以及伽马射线处理后进行化合物孵育。结果表明，探针分子与经过伽马射线氧化损伤以后的Hela细胞孵育后可以看到明显的荧光响应。（见图5）
 

图5 生物素化的邻苯-二胺-萘酰亚胺探针分子对Hela细胞荧光显色作用

3、探针分子对5fU富集
研究人员选用了实时定量PCR技术来对富集出来的5fU进行定量，并且使用了上海翊圣生物科技有限公司的Hieff qPCR SYBR® Green Master Mix (No Rox )（货号：11201ES08）这一优势产品。使用时，仅需在扩增体系中加入模板和引物即可进行实时荧光定量PCR，大大简化操作过程，缩短操作时间，降低污染几率。
 
该产品采用的DNA聚合酶配体可以随温度变化，实时调节DNA聚合酶活性。配方添加了可有效抑制非特异性PCR扩增因子与促进PCR反应扩增效率的因子，使定量PCR可以在宽广的定量区域内获得良好的线性关系。线性关系见图6。
 
图6.新贵品牌Yeasen Hieff^TM qPCR SYBR® Green Master Mix qPCR线性定量的结果
 
文章小结
    创建了一个生物素化的邻-苯-二胺-萘酰亚胺探针分子，不仅可以在生理条件下的荧光标记5fU，还能对其进行选择性的富集。这一策略可以应用于伽马射线处理以后的Hela细胞中，也具有用来研究整个基因组修饰碱基含量的潜能。设计针对5fU检测的化合物的策略可能适用于其他含有邻-苯-二胺猝灭的荧光基团。
 
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2.本活动可与“整装待发 翊起GO”活动叠加参与；
3.本活动最终解释权归上海翊圣生物所有。